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Agilent 1260 Infinity II的自動化柱前衍生功能**實現伏馬毒素FB1和FB2的高通量檢測
來源:安捷倫科技有限公司
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作者:安捷倫科技有限公司
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發布時間: 2019-03-29
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本方法是基于Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統開發出的一種用于測定伏馬毒素的自動化柱前衍生高通量液相色譜檢測方法，我們從靈敏度、重現性和線性范圍三個方面對該方法的性能進行了考察。該方法利用自動進樣器程序進樣功能、自動吸取 OPA 衍生試劑和樣品，避免了傳統柱前衍生過程中人為量取、混合和等待等繁瑣操作以及隨之引入的誤差，確保了批次間實驗結果的重現性，有助于實現伏馬毒素的高通量檢測。通過該方法，FB1 和FB2 的檢測限可達 300 pg/mL 左右，定量限可達 1 ng/mL 左右，保留時間 RSD% 均小于0.2%， 10–2500 ng/mL 范圍內有良好的線性相關性，相關系數均大于 0.9999。
簡介
伏馬毒素 (FUM) 是一種強毒性真菌毒素，普遍存在于玉米、小 麥、大米等糧食作物中，對動物和人的健康有很大的潛在危害[1]。 1993 年，伏馬毒素被**衛生組織的癌癥研究機構劃定為 2B 類 致癌物（即人類可能致癌物）[2]。 目前發現的伏馬毒素有 FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、 FC2、FC3、FC4 和 FP1 等 11 種，其中主要組分為 FB1，已成 為繼黃曲霉毒素之后的又一研究熱點。目前，我國對伏馬毒素尚 無明確的限量規定，但許多組織、**已對伏馬毒素制訂了限 量標準。歐盟對伏馬毒素（FB1 和 FB2）的總量規定玉米中限量 為 4 mg/kg[3]；瑞士規定人類食物中伏馬毒素限量為 1 mg/kg[4]； 美國 FDA 規定以玉米為原料的食品中 FB 的*大限量為 2–4 mg/kg， 動物食品為 5–100 mg/kg[5]。 我國頒布的食品安全**標準中，伏馬毒素的液相色譜檢測方法 包括柱后衍生和柱前衍生兩種[3]。柱后衍生方法分析時間較長， 且儀器配置除了一臺液相色譜外，還需要一套柱后衍生系統。而 柱前衍生方法步驟又非常繁瑣，需要先用移液器分別移取 100 μL 樣品和衍生試劑，再加入樣品瓶渦旋約 30 秒，并在 2 分鐘內進 樣分析，整個衍生時間需要人為控制。而且，為了保證衍生反應 時間一致，必須完成一針進樣后才能做下一個樣品前處理，整個 過程需要操作人員全程值守。 本方法在《GB5009.240-2016 食品安全**標準 食品中伏馬毒 素的測定》[6] 中規定的柱前衍生方案的基礎上，運用 Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統的程序進樣功能，開發出一種自動化柱前 衍生的高通量快速分析方法。該方法無需額外配置設備，無需人 員值守，具有良好的重現性，而且定量限和檢測限指標**滿足 各項主要法規的要求。
實驗部分
儀器和設備
Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統，配備如下安捷倫組件：
– Agilent 1260 Infinity II 四元泵（部件號 G7111B）
– Agilent 1260 Infinity 標準自動進樣器（部件號 G7129B）
– Agilent 1260 Infinity 柱溫箱（部件號 G7116A）
– Agilent 1260 Infinity 熒光檢測器（部件號 G7121B），配備標準檢 測池 (8 μL)
標樣配制
將伏馬毒素 FB1 和 FB2 標準混合儲備液用乙腈/水 (50%/50%) 逐級 稀釋為 2500、500、250、125、75、25 和 10 ng/mL，分別對應 于濃度級別 7、6、5、4、3、2、1。
自動衍生步驟
硼砂溶液和衍生試劑參照《食品安全**標準 食品中伏馬毒素的 測定》中第三法的規定進行配制。 硼砂溶液 (0.1 mol/L)：稱取硼砂 3.8 g，用水溶解并稀釋至 100 mL，混合均勻。取該溶液 1 mL 置于 2 mL 樣品瓶中，放在 自動進樣器的 P1-A1 位置。
衍生試劑：準確稱取 40 mg 鄰苯二甲醛，溶于 1 mL 甲醇中，用 5 mL 硼砂溶液進行稀釋，并加入 50 μL 2-巰基乙醇，混合均勻。 取該溶液 100 μL 置于 250 μL 內插管中，然后將內插管放入 2 mL 棕色樣品瓶中，放在自動進樣器的 P1-A2 位置。剩余衍生試劑放 入 –20 °C 冰箱中冷藏，1 周內使用未發現異常。
色譜條件
結果與討論
使用上述方法對伏馬毒素 FB1 和 FB2 標準樣品進行分析，第 5 級 濃度的標準樣品分析結果如圖 1 所示。結果表明，采用 Plus C18 超**短色譜柱對衍生產物進行分離，能夠在 9 min 內獲得良好 的分離效果，分離時間較**標準方法所需的 16 min 縮短了近 一半。
峰面積和保留時間重現性考察
對第 3 級濃度 (75 ng/mL) 的伏馬毒素標樣進行 5 次重復分析，以 考察峰面積和保留時間的重現性。結果顯示 FB1 和 FB2 的保留時 間 RSD% 均小于 0.2%，且峰面積 RSD% 均小于 1.1%，滿足** 標準中兩次獨立測定結果的差值不超過算數平均值 20% 的要求， 具體結果見表 3。之所以能夠獲得良好的峰面積重現性，主要是 由于自動化柱前衍生過程中涉及的樣品和溶劑的量取均采用高精 度計量泵來實施。而且，整個衍生反應流程一致，時間恒定，從 而使得衍生效果穩定，定量結果可靠。
線性范圍考察
依次將不同濃度的標準樣品按濃度從低到高進樣，每個濃度點進 樣三次，以濃度為橫坐標、每個濃度下 FB1 和 FB2 峰面積的平均 值為縱坐標繪制標準曲線，結果如圖 2 所示。無論是在低濃度范 圍 (10–500 ng/mL) 還是在高濃度范圍 (10–2500 ng/mL)，FB1 和 FB2 均獲得了良好的線性相關性，相關系數均大于 0.9999。
靈敏度考察
對第 1 級濃度 (10 ng/mL) 的標樣進樣分析以考察方法的靈敏度。結果如圖 3 所示。在該濃度下，FB1 的信噪比為 94，FB2 的信 噪比為 143。由此推斷，FB1 和 FB2 的檢測限可達 300 pg/mL 左右，定量限可達 1 ng/mL 左右；而**標準中指出，當稱樣量為 5 g 時，FB1、FB2 的檢測限分別為 17 μg/kg、8 μg/kg，定量限分別為 50 μg/kg、25 μg/kg。因此，本方法**滿足**標準方法 要求。
結論
本研究使用 Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統的程序進樣功 能，對伏馬毒素 FB1 和 FB2 進行自動衍生，可有效防止 FB1 和 FB2 衍生產物的降解。與**標準方法相比，該方法可大幅提高 檢測效率，降低實驗室人工成本。并且該方法具有非常良好的靈 敏度、線性和重現性，檢測結果可靠，是一種非常適合于大批量 樣品高通量分析的方法。
參考文獻
1. W.J. Kong, et al. Analysis of fumonisins B1 and B2 in spices and aromatic and medicinal herbs by HPLC-FLD with on-line post-column derivatization and positive confirmation by LCMS/MS. Analyst, 2012, 137: 3166-3174
2. K. C.Piancentini, et al. Mycotoxin analysis of industrial beers from Brazil: The influence of fumonisin B1 and deoxynivalenol in beer quality. Food Chem. 2017, 218: 64-69
3. SENYUVA Hamide, et al. Determination of Fumonisins B1 and B2 in Corn by LC/MS with Immunoaffinity Column Cleanup: Interlaboratory Study. JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL 2010, 93, 611-621
4. Ildiko′Barna-Vetro′, et al. Development of a sensitive ELISA for the de termination of fumonisin B1 in cereals. J Agric Food Chem. 2000, 48, 2821- 2825
5. USFDA. Draft guidance for industry: fumonisin levels in human foods and animal feeds. 2006 6. GB5009. 240-2016 食品安全**標準 食品中伏馬毒素的測定
伏馬毒素 (FUM) 是一種強毒性真菌毒素，普遍存在于玉米、小 麥、大米等糧食作物中，對動物和人的健康有很大的潛在危害[1]。 1993 年，伏馬毒素被**衛生組織的癌癥研究機構劃定為 2B 類 致癌物（即人類可能致癌物）[2]。 目前發現的伏馬毒素有 FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、 FC2、FC3、FC4 和 FP1 等 11 種，其中主要組分為 FB1，已成 為繼黃曲霉毒素之后的又一研究熱點。目前，我國對伏馬毒素尚 無明確的限量規定，但許多組織、**已對伏馬毒素制訂了限 量標準。歐盟對伏馬毒素（FB1 和 FB2）的總量規定玉米中限量 為 4 mg/kg[3]；瑞士規定人類食物中伏馬毒素限量為 1 mg/kg[4]； 美國 FDA 規定以玉米為原料的食品中 FB 的*大限量為 2–4 mg/kg， 動物食品為 5–100 mg/kg[5]。 我國頒布的食品安全**標準中，伏馬毒素的液相色譜檢測方法 包括柱后衍生和柱前衍生兩種[3]。柱后衍生方法分析時間較長， 且儀器配置除了一臺液相色譜外，還需要一套柱后衍生系統。而 柱前衍生方法步驟又非常繁瑣，需要先用移液器分別移取 100 μL 樣品和衍生試劑，再加入樣品瓶渦旋約 30 秒，并在 2 分鐘內進 樣分析，整個衍生時間需要人為控制。而且，為了保證衍生反應 時間一致，必須完成一針進樣后才能做下一個樣品前處理，整個 過程需要操作人員全程值守。 本方法在《GB5009.240-2016 食品安全**標準 食品中伏馬毒 素的測定》[6] 中規定的柱前衍生方案的基礎上，運用 Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統的程序進樣功能，開發出一種自動化柱前 衍生的高通量快速分析方法。該方法無需額外配置設備，無需人 員值守，具有良好的重現性，而且定量限和檢測限指標**滿足 各項主要法規的要求。
實驗部分
儀器和設備
Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統，配備如下安捷倫組件：
– Agilent 1260 Infinity II 四元泵（部件號 G7111B）
– Agilent 1260 Infinity 標準自動進樣器（部件號 G7129B）
– Agilent 1260 Infinity 柱溫箱（部件號 G7116A）
– Agilent 1260 Infinity 熒光檢測器（部件號 G7121B），配備標準檢 測池 (8 μL)
標樣配制
將伏馬毒素 FB1 和 FB2 標準混合儲備液用乙腈/水 (50%/50%) 逐級 稀釋為 2500、500、250、125、75、25 和 10 ng/mL，分別對應 于濃度級別 7、6、5、4、3、2、1。
表 1. 標樣配制
自動衍生步驟
硼砂溶液和衍生試劑參照《食品安全**標準 食品中伏馬毒素的 測定》中第三法的規定進行配制。 硼砂溶液 (0.1 mol/L)：稱取硼砂 3.8 g，用水溶解并稀釋至 100 mL，混合均勻。取該溶液 1 mL 置于 2 mL 樣品瓶中，放在 自動進樣器的 P1-A1 位置。
衍生試劑：準確稱取 40 mg 鄰苯二甲醛，溶于 1 mL 甲醇中，用 5 mL 硼砂溶液進行稀釋，并加入 50 μL 2-巰基乙醇，混合均勻。 取該溶液 100 μL 置于 250 μL 內插管中，然后將內插管放入 2 mL 棕色樣品瓶中，放在自動進樣器的 P1-A2 位置。剩余衍生試劑放 入 –20 °C 冰箱中冷藏，1 周內使用未發現異常。
表 2. 自動衍生方法設置
色譜條件
| 色譜柱 |
Zorbax RRHD Plus C18, 3.0 × 50 mm, 1.8 μm |
| 柱溫 |
40 oC |
| 進樣量 |
4 μL（自動進樣器自動衍生） |
| 流動相 |
A 相：10 mmol/L KH2PO4，pH 2.3（H3PO4 調節） B 相：MeOH/ACN (50%/50%) |
| 流速 |
0.8 mL/min |
| 熒光檢測器 |
激發波長：335；發射波長：440；PMT 增益：12；采樣頻率：9.26 Hz |
| 剃度時間表 |
時間（min） B% 0 50 3 70 6 70 6.1 50 9 50 |
結果與討論
使用上述方法對伏馬毒素 FB1 和 FB2 標準樣品進行分析，第 5 級 濃度的標準樣品分析結果如圖 1 所示。結果表明，采用 Plus C18 超**短色譜柱對衍生產物進行分離，能夠在 9 min 內獲得良好 的分離效果，分離時間較**標準方法所需的 16 min 縮短了近 一半。
圖 1. 250 ng/mL 伏馬毒素標準樣品中 FB1 和 FB2 的分離結果
峰面積和保留時間重現性考察
對第 3 級濃度 (75 ng/mL) 的伏馬毒素標樣進行 5 次重復分析，以 考察峰面積和保留時間的重現性。結果顯示 FB1 和 FB2 的保留時 間 RSD% 均小于 0.2%，且峰面積 RSD% 均小于 1.1%，滿足** 標準中兩次獨立測定結果的差值不超過算數平均值 20% 的要求， 具體結果見表 3。之所以能夠獲得良好的峰面積重現性，主要是 由于自動化柱前衍生過程中涉及的樣品和溶劑的量取均采用高精 度計量泵來實施。而且，整個衍生反應流程一致，時間恒定，從 而使得衍生效果穩定，定量結果可靠。
表 3. FB1 和 FB2 的保留時間和峰面積重現性 (n = 5)
線性范圍考察
依次將不同濃度的標準樣品按濃度從低到高進樣，每個濃度點進 樣三次，以濃度為橫坐標、每個濃度下 FB1 和 FB2 峰面積的平均 值為縱坐標繪制標準曲線，結果如圖 2 所示。無論是在低濃度范 圍 (10–500 ng/mL) 還是在高濃度范圍 (10–2500 ng/mL)，FB1 和 FB2 均獲得了良好的線性相關性，相關系數均大于 0.9999。
圖 2. FB1 和 FB2 的低濃度范圍（10–500 ng/mL，A 和 C）和高濃度范圍（10–2500 ng/mL，B 和 D）標準曲線
靈敏度考察
對第 1 級濃度 (10 ng/mL) 的標樣進樣分析以考察方法的靈敏度。結果如圖 3 所示。在該濃度下，FB1 的信噪比為 94，FB2 的信 噪比為 143。由此推斷，FB1 和 FB2 的檢測限可達 300 pg/mL 左右，定量限可達 1 ng/mL 左右；而**標準中指出，當稱樣量為 5 g 時，FB1、FB2 的檢測限分別為 17 μg/kg、8 μg/kg，定量限分別為 50 μg/kg、25 μg/kg。因此，本方法**滿足**標準方法 要求。
圖 3. 10 ng/mL 伏馬毒素標樣中 FB1 和 FB2 的分離結果
結論
本研究使用 Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統的程序進樣功 能，對伏馬毒素 FB1 和 FB2 進行自動衍生，可有效防止 FB1 和 FB2 衍生產物的降解。與**標準方法相比，該方法可大幅提高 檢測效率，降低實驗室人工成本。并且該方法具有非常良好的靈 敏度、線性和重現性，檢測結果可靠，是一種非常適合于大批量 樣品高通量分析的方法。
參考文獻
1. W.J. Kong, et al. Analysis of fumonisins B1 and B2 in spices and aromatic and medicinal herbs by HPLC-FLD with on-line post-column derivatization and positive confirmation by LCMS/MS. Analyst, 2012, 137: 3166-3174
2. K. C.Piancentini, et al. Mycotoxin analysis of industrial beers from Brazil: The influence of fumonisin B1 and deoxynivalenol in beer quality. Food Chem. 2017, 218: 64-69
3. SENYUVA Hamide, et al. Determination of Fumonisins B1 and B2 in Corn by LC/MS with Immunoaffinity Column Cleanup: Interlaboratory Study. JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL 2010, 93, 611-621
4. Ildiko′Barna-Vetro′, et al. Development of a sensitive ELISA for the de termination of fumonisin B1 in cereals. J Agric Food Chem. 2000, 48, 2821- 2825
5. USFDA. Draft guidance for industry: fumonisin levels in human foods and animal feeds. 2006 6. GB5009. 240-2016 食品安全**標準 食品中伏馬毒素的測定
來源：安捷倫科技有限公司
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