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       C18這種固定相目前主導(dǎo)了HPLC柱市場，雖然不斷有新的固定相被創(chuàng)造出來推向市場，C18目前仍占有50-60%的市場。在USP數(shù)據(jù)庫中，收錄的L1有接近800種（L1主要是C18，也含有一些極性封端和極性嵌入的C18，**進(jìn)入U(xiǎn)SP收錄的L1型色譜柱），而且這個數(shù)據(jù)在不斷增長。

       在我的實(shí)際工作中，有遇到不少由于使用不當(dāng)或者不可避免的因素而導(dǎo)致色譜柱峰形變差、柱效下降、柱壓升高等情況。色譜柱是一種耗材，肯定是有一定的壽命的，有些時(shí)候遇到這種情況，再生的成本（特別是儀器緊張時(shí)的時(shí)間成本）可能也挺高，而且不一定有效。

      據(jù)說在有些歐美藥企，為了保證數(shù)據(jù)重復(fù)性，色譜柱是規(guī)定了使用次數(shù)的，到使用次數(shù)了就換，不管柱子還能不能繼續(xù)使用。但是對于國內(nèi)，一支進(jìn)口色譜柱的成本可能就是一個實(shí)驗(yàn)人員半個月或者一個月的工資了，企業(yè)不得不考慮色譜柱的成本問題；另外對于很多經(jīng)費(fèi)有限的高校的學(xué)生也是這樣，可能一支柱子要伴隨他/她的整個研究生歲月。有時(shí)候下班了還會接到他們焦慮的電話：我的柱子出問題了，還能不能搶救一下？

首先，我會讓他們給我?guī)讉€信息:

1. 色譜柱的背壓（backpressure）是否有明顯升高？在這里，建議使用者在新柱子開封后先按照柱報(bào)告的條件測試一下柱子，如果出現(xiàn)柱效或者保留時(shí)間等與柱報(bào)告上的數(shù)據(jù)差異較大，可以聯(lián)系供貨商進(jìn)行售后；同時(shí)可以記錄下在這臺儀器上測試時(shí)的背壓情況，這就可以作為背壓升高情況的參考值；

2.是否所有的色譜峰都出現(xiàn)了拖尾或者變形（如肩峰或裂峰），如下圖:

圖一拖尾峰和變形峰

有幾種情況：

      1. 只出現(xiàn)現(xiàn)象1，即背壓升高。這種情況不一定是色譜柱的問題，那有可能是儀器體系出現(xiàn)了問題，比如某些管路出現(xiàn)不通暢；或者使用的流動相黏度過大（如異丙醇）、流速過大；也有可能是色譜柱老化了（這種情況下色譜柱的背壓是緩慢增加的）；或者使用了高濃度的緩沖鹽或者長時(shí)間把柱子保存在含有緩沖液的流動相中，這樣會導(dǎo)致鹽在色譜柱中析出而造成柱壓升高；

       2.只出現(xiàn)現(xiàn)象2，即所有峰都拖尾或者變形，而柱壓基本沒有上升。這種情況有可能是色譜柱安裝不當(dāng)，比如死體積過大或者柱子填充不好，出現(xiàn)柱床塌陷；也有可能色譜柱出現(xiàn)樣品過載了，這個時(shí)候可以檢查下進(jìn)樣量是否過大；也有可能是分析物都是堿性化合物，流動相的pH不合適，這時(shí)可以調(diào)低pH以抑制填料中硅醇的活性或者增加緩沖液濃度以提高緩沖能力；當(dāng)然，也有可能是色譜柱的柱頭被強(qiáng)保留的物質(zhì)污染，這個時(shí)候可能會出現(xiàn)連續(xù)跑空白樣品時(shí)會在同樣的地方出峰的現(xiàn)象；

       3. 同時(shí)出現(xiàn)現(xiàn)象1和現(xiàn)象2，即色譜柱背壓明顯升高，同時(shí)色譜峰出現(xiàn)拖尾或者變形，這種情況很有可能是色譜柱的篩板堵了或者柱頭污染了。

       在這里，我再強(qiáng)調(diào)一遍，解決問題zui好的辦法是預(yù)防問題的產(chǎn)生。出現(xiàn)色譜柱污染或者堵的情況很多時(shí)候是可以避免的，比如安裝在線過濾器或者保護(hù)柱等等，這里就不展開講了。下面講一下出現(xiàn)篩板堵了或者柱頭污染了怎么處理，有兩種方法：

      1. 把柱子反過來用。這并不適用于所有的柱子，因?yàn)橛行┲拥膬啥撕Y板的孔隙大小不一致，反沖可能把填料沖出來而造成柱床塌陷。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，這個操作可以解決一部分色譜柱的峰拖尾或者變形的問題；

       2. 用強(qiáng)洗脫的溶劑沖洗。很多文獻(xiàn)數(shù)據(jù)認(rèn)為反相HPLC中溶劑強(qiáng)度順序?yàn)椋?/span>水（*弱）< 甲醇 < 乙腈 < 乙醇< si氫呋喃 < 丙醇 < 二氯甲烷（zui強(qiáng)），由于二氯甲烷很強(qiáng)，因此可用于清洗被強(qiáng)保留樣品組分污染的RPC柱。

      一般來說，反沖效果更好，這樣強(qiáng)保留成分就不需要走過整個色譜柱了。推薦的保守的清洗方法是：

1、20倍柱體積水：乙腈=95%：5%沖洗柱子，以除去系統(tǒng)中可能殘存的緩沖鹽（如果確定系統(tǒng)中不含緩沖鹽此步驟可以略過）；

2、異丙醇低流速（至少減半）沖洗，沖洗的時(shí)間視情況而定；

3、20倍柱體積水：乙腈=95%：5%

4、用所需的流動相比例重新平衡色譜柱。

      如果用保守的方法沒有什么效果，又不想放棄這支色譜柱，我這里有一個參考了好幾本權(quán)威專著的方法，其中用到了更強(qiáng)的流動相：

1、20倍柱體積水：乙腈=95%：5%沖洗柱子，以除去系統(tǒng)中可能殘存的緩沖鹽（如果確定系統(tǒng)中不含緩沖鹽此步驟可以略過）；

2、20倍柱體積異丙醇低流速（至少減半）沖洗；

3、20倍柱體積的二氯甲烷：含0.1%氫氧化銨的甲醇=96%：4%沖洗柱子；

4、20倍柱體積異丙醇低流速（至少減半）沖洗；

5、20倍柱體積水：乙腈=95%：5%

6.、用所需的流動相比例重新平衡色譜柱。

      關(guān)于二氯甲烷能不能進(jìn)C18色譜柱的問題，我去問過有過這么操作的同行，有的說快速沖一下確實(shí)可以很好地清洗柱子，但也有反映說沖過之后柱效損失很大。所以本方法僅供準(zhǔn)備*后再搶救一把的色譜柱來嘗試，嘗試完后麻煩也給我反饋下效果。這里有需要注意的是二氯甲烷和水是不互溶的，所以在使用二氯甲烷前后都需要用異丙醇充分過渡。

      *后，關(guān)于柱體積的計(jì)算可以找到很多文章來詳細(xì)說明，這里就不贅述。附錄一個全多孔硅膠填料色譜柱的柱體積數(shù)據(jù)：